Gibco CTS Dynabeads 磁珠的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用Gibco CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠可以使初始和早期記憶T細(xì)胞幾乎100%恢復(fù)。這種同時(shí)進(jìn)行T細(xì)胞分離和活化的一步法能夠產(chǎn)生純凈且被均勻活化的T細(xì)胞。用CTS Dynabeads CD3/CD28擴(kuò)增的CD4+和CD8+ T細(xì)胞在第10天維持早期記憶表型并且具有克隆多樣性。早期去除磁珠是可行的并且提高γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠可提供可靠的結(jié)果，已用于80多種臨床試驗(yàn)和商業(yè)T細(xì)胞藥物生產(chǎn)中。

實(shí)驗(yàn)方法:

1. 使用CTS Dynabeads CD3/CD28(磁珠:細(xì)胞比例為3:1)在細(xì)胞培養(yǎng)袋中分離并激活來(lái)自健康供體的PBMC的T細(xì)胞，其中CTS OpTmizer T細(xì)胞擴(kuò)增SFM補(bǔ)充有CTS免疫細(xì)胞血清替代物，Gibco™ L-谷氨酰胺和Gibco™慶大霉素(不*培養(yǎng)基)。
2. 在移除磁珠后，在細(xì)胞培養(yǎng)板或者細(xì)胞培養(yǎng)袋中擴(kuò)增T細(xì)胞。
3. 將分離的和活化的T細(xì)胞在*培養(yǎng)基(不*培養(yǎng)基加100U/mL IL-2)中擴(kuò)增7–10天；在刺激后第2，3或5天磁性移除CTS Dynabeads CD3/CD28。
4. 用涂有重組人纖維蛋白試劑的微孔板中的編碼EGFP的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。
5. 使用流式細(xì)胞分析軟件在細(xì)胞分析儀上進(jìn)行T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。
6. 使用Invitrogen™ Dynabeads™ mRNA DIRECT™純化試劑盒分離來(lái)自T細(xì)胞的RNA，并使用Ion AmpliSeq™試劑盒通過(guò)TCRβ測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠不需要上游T細(xì)胞選擇，因?yàn)樵摷夹g(shù)基于CD3和CD28共表達(dá)同時(shí)分離和激活初始和早期記憶T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示CD3+ CD28+ T細(xì)胞被分離，恢復(fù)率高(>90%)(圖2)。在激活后第3天，細(xì)胞被均勻刺激(>95% CD25+)并具有高純度(>95% CD3+)(圖3)。

（CTS Dynabeads CD3/CD28優(yōu)先分離CD3+ CD28+ 細(xì)胞。將PBMC與CTS Dynabeads CD3/CD28以3:1磁珠:細(xì)胞的比例孵育30分鐘，并分析陰性(非分離)級(jí)分并用于計(jì)算分離效率。A代表性細(xì)胞圖，證明CD3+ CD28+ T細(xì)胞分離的效率。B恢復(fù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)(n = 9)。）

（用CTS Dynabeads CD3/CD28分離的T細(xì)胞被均勻刺激且具有高純度。(A，B)在分析活化標(biāo)記物之前，將分離的T細(xì)胞擴(kuò)增3天。(C，D)在第0天(起始材料)和激活后第3天和第10天分析T細(xì)胞純度。）

（T細(xì)胞擴(kuò)增后克隆多樣性增加。用CTS Dynabeads CD3/CD28分離并活化T細(xì)胞。(A)在第0，3和10天，收獲樣品用于TCRβ測(cè)序。(B)在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在激活后第3天也用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。）

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

• CTS Dynabeads CD3/CD28分離CD3+ CD28+ T細(xì)胞，效率高，純度高。
• 分離和活化的CD4+和CD8+ T細(xì)胞在10天內(nèi)擴(kuò)增100至800倍，同時(shí)保留年輕表型(CD45RA+/- CD127+/- CD62L+ PD-1-)。
• 基于TCRβ測(cè)序，擴(kuò)增的T細(xì)胞具有增加的克隆多樣性。
• 第2天去除磁珠提高了γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

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品牌                            貨號(hào)                                     名稱

Gibco™                    40203D              CTS™ (Cell Therapy Systems) Dynabeads™ CD3/CD28

Gibco™                    11161D                Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation

BioGems                 05121-25             Anti-Human CD3 SAFIRE Purified